革蘭氏染色液試劑盒體外診斷試劑盒是于1884年所發(fā)明，是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，是一種復(fù)染法。未經(jīng)染色之細(xì)菌，由于其與周圍環(huán)境折光率差別甚小，故在顯微鏡下極難觀察。染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對(duì)比，可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征，而用以分類鑒定。通過此法染色，可將細(xì)菌鑒別為革蘭陽(yáng)性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）兩大類。

 

　　細(xì)菌的不同顯色反應(yīng)是由于細(xì)胞壁對(duì)乙醇的通透性和抗脫色能力的差異，主要是肽聚糖層厚度和結(jié)構(gòu)決定的。經(jīng)結(jié)晶紫染色的細(xì)胞用碘液處理后形成不溶性復(fù)合物，乙醇能使它脫色。在革蘭陰性細(xì)胞染色中，乙醇或丙酮破壞了胞壁外膜、損傷肽聚糖層和細(xì)胞質(zhì)膜，結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物從細(xì)胞中滲漏出來(lái)，當(dāng)再用其他染色液復(fù)染時(shí)，顯現(xiàn)紅色。紅色染料雖然也能進(jìn)入已染成紫色的G+細(xì)胞，但被紫色蓋沒，所以紅色顯示不出來(lái)。在革蘭陽(yáng)性細(xì)胞染色中，乙醇還能使厚的肽聚糖層脫水，導(dǎo)致孔隙變小，由于結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物分子太大，不能通過細(xì)胞壁，不易脫色，所以保持著紫色。

 

　　革蘭氏染色液試劑盒體外診斷試劑操作步驟（僅供參考）：

 

　　1、涂片：取待檢細(xì)菌，于載玻片中央涂成薄層或者或在載玻片上滴加少許無(wú)菌水，取菌與的水混合均勻，涂成一薄層。

 

　　2、干燥：涂片后在室溫下自然干燥，也可在酒精燈上略加溫，使之迅速干燥。

 

　　3、固定：手持載玻片一端，標(biāo)本面朝上，在酒精燈的火焰外側(cè)快速來(lái)回移動(dòng)3~5次，每次1s，溫度不宜過高，防止菌體蛋白變性，放置待涼后染色。也可以用甲醇或乙醇固定。

 

　　4、初染：滴加結(jié)晶紫染色液染色1~2min，清水沖洗去染色液。

 

　　5、媒染：滴加Gram碘液，并覆蓋載玻片，室溫放置1~2min，水洗。

 

　　6、脫色：滴加脫色液，搖動(dòng)10～30s，直至流下的脫色液不出現(xiàn)紫色時(shí)為止，立即用水沖去脫色液，終止反應(yīng)。

 

　　7、復(fù)染：滴加沙黃染色液染色30s~1min，水洗。

 

　　8、干燥。

 

　　9、鏡檢：置油鏡觀察。

 

　　革蘭氏染色液試劑盒體外診斷試劑盒注意事項(xiàng)：

 

　　1、涂片之前，應(yīng)事先在背面做好圓圈標(biāo)記，以便判斷后續(xù)試驗(yàn)的位置。

 

　　2、取細(xì)菌時(shí)，應(yīng)注意自我防護(hù)，拔或塞試管塞時(shí)，應(yīng)將試管口通過火焰略加燒灼，zui后將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。

 

　　3、加熱固定涂片時(shí)，應(yīng)注意玻片勿太靠近火焰，一般要求玻片溫度不超過60℃，以玻片背面觸及手背皮膚不覺過燙為宜。

 

　　4、革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握脫色程度，脫色時(shí)間應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷。脫色過度，陽(yáng)性菌可被誤染為陰性菌；脫色不夠，陰性菌可被誤染為陽(yáng)性菌。

 

　　5、待檢細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間也會(huì)影響染色效果，陽(yáng)性菌培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)或已死亡或細(xì)菌溶解，都常呈陰性反應(yīng)。

 

　　6、上述試劑均對(duì)人體有刺激性，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。

 

　　在我國(guó)，蘇木素伊紅染色液試劑盒體外診斷試劑是指：可單獨(dú)使用或與儀器、器具、設(shè)備或系統(tǒng)組合使用, 在疾病的預(yù)防、診斷、治療監(jiān)測(cè)、預(yù)后觀察、健康狀態(tài)評(píng)價(jià)以及遺傳性疾病的預(yù)測(cè)過程中, 用于對(duì)人體樣本( 各種體液、細(xì)胞、組織樣本等) 進(jìn)行體外檢測(cè)的試劑、試劑盒、校準(zhǔn)品( 物) 、質(zhì)控品( 物)等。

 

　　隨著我國(guó)臨床診斷需求的不斷增長(zhǎng)，以及研發(fā)技術(shù)的不斷提高，體外診斷(IVD)行業(yè)已經(jīng)成為我國(guó)醫(yī)藥行業(yè)中發(fā)展zui快，也zui活躍的細(xì)分行業(yè)之一。雖然目前我國(guó)體外診斷行業(yè)尚處于發(fā)展初期，但其發(fā)展一直受國(guó)家產(chǎn)業(yè)政策重點(diǎn)支持。將體外診斷試劑、診斷儀器、診斷相關(guān)酶制劑等產(chǎn)業(yè)的發(fā)展列為重點(diǎn)發(fā)展項(xiàng)目，將體外診斷列為戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)。

 

　　蘇木素伊紅染色液試劑盒體外診斷試劑斷行業(yè)包括儀器、試劑和耗材，其中IVD市場(chǎng)80%是試劑，本報(bào)告以診斷試劑為主，兼顧部分耗材情況，較少討論診斷儀器。

 

　　蘇木素伊紅染色液試劑盒體外診斷試劑是一種堿性染料，同媒染劑（常用的是三價(jià)的鐵或鋁的鹽）一起使用，能夠使細(xì)胞核染色。蘇木素和氧化蘇木素都沒有染色能力，但與媒染劑結(jié)合形成色淀（lake），這種色淀具有染色能力。核、染色體、著絲粒、中心體、線粒體、髓鞘等可被染成藍(lán)色以至黑色。與伊紅合用的蘇木素-伊紅雙重染色法是zui基本的一般組織的染色法，蘇木素染色原理如下：

 

　　蘇木素和伊紅在組織學(xué)上被經(jīng)常使用，碘液不同，這是一種染色街。其他常用的含有蘇木素的染色劑有磷鎢酸蘇木素染色劑，也就是磷鎢酸與蘇木素的混合物。蘇木素染色劑經(jīng)常為組織的研究使用。明礬和三價(jià)鐵鹽常常被用作媒染劑，展示核和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)。這些媒染劑的原理都是形成媒染劑－染料－組織復(fù)合體，從而顯示顏色。

 

　　蘇木素染色內(nèi)質(zhì)呈淡藍(lán)黑色，外質(zhì)收縮，剩下部分不著色或色澤更淺。圓形細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。居中的核仁呈黑色小圓點(diǎn)。核膜較薄，其內(nèi)側(cè)緣均勻，整齊地排列著一層細(xì)小的染色質(zhì)粒。核仁與核膜之間可見到核網(wǎng)。被吞噬的紅細(xì)胞呈藍(lán)黑色采用蘇木素染色液進(jìn)行免疫染色后的復(fù)染，操作步驟簡(jiǎn)便，操作時(shí)間短?？梢圆僮鞑襟E簡(jiǎn)便，操作時(shí)間短或培養(yǎng)細(xì)胞的染色，或與免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光、原位雜交等配合使用。使用蘇木素染色液染色后還可以進(jìn)行免疫染色或其它染料的復(fù)染。

 

　　1、血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

 

　　2、人凝血因子Ⅲelisa試劑盒血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

 

　　3、尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

 

　　4、細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

 

　　5、組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

 

　　6、標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

 

　　7、不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

 

　　蘇木素伊紅染色液試劑盒體外診斷試劑操作步驟：

 

　　1、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在*、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。

 

　　2、人凝血因子Ⅲelisa試劑盒加樣：分別設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

 

　　3、溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

 

　　4、配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

 

　　5、洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

 

　　6、加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

 

　　7、溫育：操作同3。

 

　　8、洗滌：操作同5。

 

　　9、顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

 

　　10、終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)。

 

　　11、蘇木素伊紅染色液試劑盒體外診斷試劑盒測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值），測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

 

　　OPD（鄰苯二胺）底物顯色一般在室外溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì)自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行，顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入終止液終止反應(yīng)。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。

 

　　TMB（四甲基聯(lián)苯胺）受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可*消退至無(wú)色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍(lán)色維持較長(zhǎng)時(shí)間（12-24小時(shí)）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)（450nm）測(cè)讀吸光值。

 

　　比色

 

　　比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗(yàn)，需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。

 

　　比色時(shí)應(yīng)先以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。

 

　　酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指于測(cè)讀全組織細(xì)胞色素C氧化酶活性染色試劑盒結(jié)果吸光度的光度計(jì)。針對(duì)固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。許多試劑公司配套供應(yīng)酶標(biāo)儀。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。舉例說，若某孔測(cè)得的A值為1.083，則該孔相對(duì)于空氣的真實(shí)A值應(yīng)為1.083±0.01(1.073～1.093)，重復(fù)測(cè)定數(shù)次，其A值均應(yīng)1.083±0.05（1.078～1.088）在之間。酶標(biāo)儀的可測(cè)范圍視各全組織細(xì)胞色素C氧化酶活性染色試劑盒的性能而不同。普通的酶標(biāo)儀在0.000～2.000，新型號(hào)的酶標(biāo)儀上限拓寬達(dá)2.900，甚至更高。超出可測(cè)上限的A值常以“*”或“over”或其它符號(hào)表示。應(yīng)注意可測(cè)范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測(cè)范圍，比如某一酶標(biāo)儀的可測(cè)范圍為0.000～2.900，而其線性范圍僅0.000～2.000，這在定量ELISA中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)予注意。

 

　　酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。

 

　　冰凍切片細(xì)胞色素C氧化酶活性染色試劑盒操作體會(huì)：

 

　　1. 控制好染色步驟；

 

　　2. 組織固定起著很重要的作用，根據(jù)不同的固定溶液可延長(zhǎng)或縮短染色時(shí)間；0.2%冰醋酸水溶溶液洗，可使色調(diào)清晰鮮艷；

 

　　3. 磷鉬酸水溶溶液對(duì)麗春紅、酸性復(fù)紅有分化作用，分化時(shí)鏡下控制， 肌纖維和纖維素呈紅色，膠原纖維呈淡粉紅色即可。

 

　　冰凍切片細(xì)胞色素C氧化酶活性染色試劑盒廣泛存在于動(dòng)物、和植物中，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并產(chǎn)生H2O2，是生物體中產(chǎn)生活性氧的代謝途徑之一。

 

　　測(cè)定原理：GOD催化產(chǎn)生H2O2，過氧化物酶在有氧存在時(shí)催化H2O2分解產(chǎn)生的氧又將鄰聯(lián)茴香胺氧化生成有色物質(zhì)，顏色深淺與葡萄糖氧化酶活性成線性關(guān)系。

 

　　是人體內(nèi)zui普遍的、不可缺乏的條件性必需氨基酸，是構(gòu)成蛋白質(zhì)*的氨基酸之一，更是某些細(xì)胞培養(yǎng)中zui基本的元素。由于谷氨酰胺不穩(wěn)定的特性，在細(xì)胞培養(yǎng)基的整合中，易自發(fā)性分解為谷氨酸和氨離子，而氨離子對(duì)細(xì)胞的毒性很強(qiáng)，因此，在細(xì)胞培養(yǎng)體系中，須密切關(guān)注谷氨酰胺的儲(chǔ)存壽命（SHELF LIFE）和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。在谷氨酰胺酶和谷氨酸脫氫酶的雙酶循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)中，L-谷氨酰胺首先發(fā)生脫氨基反應(yīng)，產(chǎn)生谷氨酸和氨離子；進(jìn)一步氨與2-酮戊二酸反應(yīng)再次產(chǎn)生谷氨酸，同時(shí)將還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸即測(cè)定NADPH（340nm  波長(zhǎng)）的濃度變化

 

　　冰凍切片細(xì)胞色素C氧化酶活性染色試劑盒樣品收集、處理及保存方法

 

　　1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

 

　　2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。

 

　　3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。

 

　　4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。

 

　　5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

 

　　自備物品

 

　　15毫升錐形離心管：用于制備樣品的容器

 

　　比色皿：用于比色的容器

 

　　96孔酶標(biāo)板：用于比色的容器

 

　　分光光度儀：用于比色分析

 

　　酶標(biāo)儀：用于微量樣品比色分析