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 細(xì)菌賴(lài)氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶（LYS-GINGIPAIN）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

 細(xì)菌賴(lài)氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶（LYS-GINGIPAIN）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)單肽化合物底物acetyl-Lys-pNA，受到賴(lài)氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶的水解，釋放出黃色對(duì)硝基苯胺，即采用比色法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種牙周炎細(xì)菌裂解萃取液、培養(yǎng)上清、牙周縫隙液體等樣品賴(lài)氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶的特異活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

牙齦卟啉菌蛋白酶（gingipain）是一種胰蛋白酶類(lèi)半胱氨酸蛋白酶（cysteine proteinase），常見(jiàn)于細(xì)菌表面、細(xì)胞外基質(zhì)囊泡內(nèi)以及細(xì)菌培養(yǎng)上清，為膜結(jié)合型和細(xì)胞外分泌型，有2個(gè)類(lèi)型：精氨酸依賴(lài)特異性（arginine specific；Rgp）和賴(lài)氨酸依賴(lài)特異性（lysine specific；Kgp）。前者有2個(gè)同工酶：RgpA和RgpB：RgpA又分成HRgpA、RgpA（cat）和mtRgpA；RgpB又分成RgpB和mtRgpB。牙齦卟啉菌蛋白酶也是一種毒力因子，為革蘭氏陰性厭氧細(xì)菌牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）、等多種細(xì)菌生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，使血液凝結(jié)和纖維溶解（fibrinolytic）通路，以及免疫系統(tǒng)失調(diào)，激活激肽釋放酶（kallikerin）和激肽（kinin）通路，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，活化基質(zhì)金屬蛋白酶和血小板，切離層粘連蛋白（laminin）、纖連蛋白（fibronectin）、膠原蛋白等，間接促成牙周組織浸入和破壞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、CAM分子分解和細(xì)胞脫離（失巢凋亡anoikis），導(dǎo)致牙周病發(fā)生，甚至心血管疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和阿茨罕默癥等。牙齦卟啉菌蛋白酶成為藥物靶標(biāo)。基于人工合成的單肽化合物底物acetyl-Lys-p-Nitroaniline；乙酰賴(lài)氨酰對(duì)硝基苯胺），受到賴(lài)氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶的水解，釋放出黃色對(duì)硝基苯胺（405nm 波長(zhǎng)），來(lái)定量測(cè)定賴(lài)氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶的特異活性。賴(lài)氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

 裂解液（Reagent A）         毫升

 緩沖液（Reagent B）         毫升

 陰性液（Reagent C）           毫升

 底物液（Reagent D）           微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)              1份

保存方式

保存在-20℃冰箱里； 底物液（Reagent D）避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶(hù)自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品沉淀

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)物孵育

96孔板或100微升1厘米光徑比色皿：用于樣品比色測(cè)定的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品制備

1． 準(zhǔn)備好500微升待測(cè)細(xì)菌（OD600＝0.8至1，即1至2 X 10⁷細(xì)菌/毫升）

2． 轉(zhuǎn)移到到1.5毫升離心管

3． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g（或3500RPM，例如EPPENDORF 5415）

4． 小心移取上清液到新鮮的1.5毫升離心管——此為占85%細(xì)菌外分泌型酶蛋白

5． 加入xx微升 裂解液（Reagent A），充分混勻

6． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

7． 置于冰槽里15分鐘

8． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

9． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管——此為占細(xì)菌內(nèi)結(jié)合型酶蛋白

10． 分別移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

11． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好上述制備的待測(cè)樣品

2． 設(shè)定好酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)405nm

3． 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 底物液（Reagent D）手心融化，避免光照

三、 活性測(cè)定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取xx微升 緩沖液（Reagent B）到相應(yīng)孔里

3． 分別加入xx微升 陰性液（Reagent C）或上述制備的待測(cè)樣品（50微克蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）

4． 分別加入xx微升 底物液（Reagent D）

5． 輕輕搖動(dòng)96孔板（注意：避免氣泡）

6． 在37℃溫度下孵育30分鐘（注意：可見(jiàn)反應(yīng)孔里呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的黃色）

7． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)或轉(zhuǎn)移到100微升比色皿，在分光光度儀里檢測(cè)

8． 活性計(jì)算：

（1） 酶標(biāo)儀檢測(cè)

（2） 比色皿檢測(cè)

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為21次（96孔板）操作，包括背景對(duì)照

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次

4． 樣品須澄清，且避免反復(fù)凍融

5． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過(guò)低，即30分鐘讀數(shù)過(guò)低，則可以延長(zhǎng)反應(yīng)孵育時(shí)間至2小時(shí)；其次增加樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）

6． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

7． 賴(lài)氨酸牙齦卟啉菌蛋白酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.6條件下，每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾單肽化合物底物所需的酶量作為一個(gè)活性單位

8． 本公司提供系列牙齦卟啉菌蛋白酶學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感