通用型DNA損傷彗星檢測(cè)*試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 通用型DNA損傷彗星檢測(cè)*試劑是一種旨在采用組織細(xì)胞堿性凝膠電泳，在電場(chǎng)環(huán)境下，損傷變性的DNA片段遷移形成特定的形態(tài)，即DNA移動(dòng)尾巴，來進(jìn)行體外評(píng)價(jià)和半定量分析DNA損傷程度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于新鮮動(dòng)物細(xì)胞、組織、血液、骨髓等樣品的DNA損傷研究，包括DNA鏈斷裂、氧化性堿基損傷、DNA剪切損傷、DNA交聯(lián)、DNA修復(fù)等，應(yīng)用于環(huán)境和藥物毒理學(xué)、放射學(xué)、氧化應(yīng)急反應(yīng)等研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡便，重復(fù)一致。

技術(shù)背景

彗星檢測(cè)技術(shù)（Comet assay），又稱為單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)（single cell gel electrophoresis assay；SCGE）或微凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)（microgel electrophoresis assay），是基于變性切離的DNA片段，在電場(chǎng)的影響下，從細(xì)胞中移出的原理，而完整的超螺旋DNA仍然保持在細(xì)胞核內(nèi)。通過凝膠電泳，呈現(xiàn)出分子遷移圖形，形成彗星拖尾（comet tail）現(xiàn)象，即完整DNA的細(xì)胞染色體為“頭”，而松散和斷裂的DNA為“尾”，以此評(píng)價(jià)DNA損傷程度。這是分析單一細(xì)胞DNA鏈斷裂的敏感方法之一。其技術(shù)方法的基本步驟是：*，細(xì)胞固定包埋在凝膠里；第二，細(xì)胞裂解處理；第三，DNA變性處理；第四，電泳遷移；第五，染色和圖像分析。由此觀察DNA遷移形態(tài)，進(jìn)行體外檢測(cè)，成為細(xì)胞DNA損傷研究的基本手段。其中電泳條件將決定檢測(cè)的敏感程度。堿性電泳（alkaline electrophoresis）為常規(guī)電泳檢測(cè)，可以檢測(cè)單鏈DNA斷裂、雙鏈DNA斷裂、大部分無嘌呤核酸位點(diǎn)（apurinic site）和無嘧啶核酸位點(diǎn)（apyrimidic site）、堿不穩(wěn)定DNA結(jié)合物（alkali-labile DNA adduct）等DNA損傷。

產(chǎn)品內(nèi)容

 膠體液（Reagent A）  3毫升

 基質(zhì)液（Reagent B） 10毫升

 清理液（Reagent C） 20毫升

 裂解液（Reagent D）     200毫升

 電泳液（Reagent E）     500毫升

 中和液（Reagent F）     200毫升

 染色液（Reagent G）  1毫升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存 染色液（Reagent G）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

無離子水：用于稀釋電泳緩沖液

磨砂載玻片和蓋玻片：用于放置樣品進(jìn)行微凝膠電泳的器材

電泳槽：用于微凝膠電泳的裝置

恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

90 mm培養(yǎng)皿：用于樣品處理、染色等的容器

熒光顯微鏡：用于觀察細(xì)胞彗星現(xiàn)象

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 瓊脂載玻片準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備1張*磨砂載玻片，磨砂面朝上

2． 將 膠體液（Reagent A）置于微波爐里加熱溶化（注意：避免溢出）

3． 放進(jìn)45℃恒溫水槽孵育10分鐘

4． 移出100微升 膠體液（Reagent A）到載玻片中間

5． 蓋上潔凈的蓋玻片

6． 輕壓蓋玻片5分鐘，確保膠體液鋪展

7． 放進(jìn)4℃冰箱里備用

二、 樣品準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)開始前，將 基質(zhì)液（Reagent B）置于微波爐里加熱溶化，然后放進(jìn)45℃恒溫水槽備用。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備好新鮮培養(yǎng)細(xì)胞、組織樣本、血液樣品等 （1 X 10⁵細(xì)胞）

2． 移入到1.5毫升離心管

3． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g

4． 小心抽去上清液

5． 加入1毫升 清理液（Reagent C），混勻顆粒群

6． 移取20微升到新的1.5毫升離心管

7． 加入180微升在45℃恒溫水槽里的 基質(zhì)液（Reagent B）

8． 用槍頭上下抽吸混勻

9． 用大拇指推動(dòng)移走上述制備的載玻片上的蓋玻片

10． 即刻移取75微升細(xì)胞基質(zhì)混合液到載玻片上

11． 用新的蓋玻片蓋上

12． 輕壓蓋玻片5分鐘，確保細(xì)胞基質(zhì)混合液鋪展

13． 放進(jìn)4℃冰箱里冷卻10分鐘，直至膠體凝結(jié)，避免光照

14． 用大拇指推動(dòng)移走蓋玻片

15． 將載玻片放進(jìn)9cm培養(yǎng)皿

16． 加入10毫升預(yù)冷的 裂解液（Reagent D）

17． 放進(jìn)4℃冰箱里孵育60分鐘

18． 倒去裂解液

三、 凝膠電泳

1． 移出25毫升 電泳液（Reagent E）到250毫升三角燒瓶里

2． 加入225毫升無離子水，充分混勻后，標(biāo)記為 電泳工作液

3． 加入10毫升 電泳工作液到上述9cm培養(yǎng)皿

4． 室溫下孵育30分鐘

5． 倒去電泳工作液

6． 將載玻片置于（具有溫度控制的）水平電泳槽里

7． 加入適量的 電泳工作液到電泳槽里，恰好在載玻片之上

8． 插上電源，設(shè)定電壓25伏

9． 在4℃環(huán)境下，電泳30分鐘

10． 斷開電源，取出載玻片

11． 放進(jìn)無離子水里浸潤2次，每次1秒

12． 放進(jìn)9cm培養(yǎng)皿

13． 加入10毫升 中和液（Reagent F）

14． 在4℃冰箱里孵育5分鐘

15． 倒去中和液

16． 空氣中晾干

四、 染色分析

1． 加上50微升 染色液（Reagent G）

2． 蓋上新的蓋玻片

3． 室溫下孵育5分鐘，避免光照

4． 即刻在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄：激發(fā)波長546nm；散發(fā)波長590nm

5． 室溫下避光保存，如果重新觀察，可以重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至4

6． 分析參數(shù)：

1） 形態(tài)指標(biāo)，即拖尾率目測(cè)計(jì)量（comet％）。根據(jù)熒光圖像是否象彗星一樣頭尾分明將其分為彗星樣細(xì)胞和非彗星樣細(xì)胞，計(jì)數(shù)一定量細(xì)胞中彗星樣細(xì)胞所占的比例，即彗星樣細(xì)胞發(fā)生率（comet％），估計(jì) DNA 的損傷程度。通過鏡下觀察，計(jì)數(shù)50至100個(gè)細(xì)胞，直接得到，方便實(shí)用。

2） 距離指標(biāo)，即直接在顯微鏡下或在照片上測(cè)出彗星的一些長度數(shù)值。

（1） 尾長（Tail Length；µm）：沿電泳方向尾部zui遠(yuǎn)端與頭部中心間的距離（遷移距離）――距離越長，DNA損傷越嚴(yán)重

（2） 總彗星長度（comet length；µm）：從頭至尾，電泳方向上的zui大長度――長度越大，DNA損傷越嚴(yán)重

（3） 尾長與頭部直徑比值：沿電泳方向尾部zui遠(yuǎn)端與頭部中心間的距離與頭部直徑之比――比值越大，DNA損傷越嚴(yán)重

3） 強(qiáng)度指標(biāo)，即DNA含量

（1） 頭部和尾部熒光百分比：尾部總熒光強(qiáng)度與頭部總熒光強(qiáng)度的比值——百分比越高，DNA損傷越嚴(yán)重

（2） 尾部和總彗星熒光百分比（Tail DNA％）： 檢測(cè)500個(gè)細(xì)胞

4） 矩類指標(biāo)，構(gòu)建距離、強(qiáng)度的平均關(guān)系數(shù)值

（1） 尾矩（tail moment；TM），又稱為Olive tail moment（OTM）：尾部 DNA 占總 DNA 的百分比與頭、尾部中心間距的乘積，單位為µm%或µm tail fraction

（2） 彗星矩（comet moment；CM）：以頭部中心點(diǎn)為零點(diǎn)，沿電泳方向?qū)㈠缧前匆欢ǖ拈g隔分成若干個(gè)區(qū)域（ 80 個(gè)），分別測(cè)定每個(gè)區(qū)域的熒光強(qiáng)度乘以該區(qū)域中心距零點(diǎn)的距離除以彗星總熒光強(qiáng)度

7. 構(gòu)建DNA損傷程度和藥物處理劑量（dose）或時(shí)間（time）曲線

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 整個(gè)操作，建議在暗光下進(jìn)行
• 建議使用新鮮培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞、組織、血液等；細(xì)胞量為10⁵細(xì)胞/毫升
• 可以使用100微摩爾過氧化氫或25微摩爾高錳酸鉀冰上孵育10分鐘預(yù)處理樣品作為陽性對(duì)照
• 操作時(shí)小心輕柔，避免膠體脫位
• 電泳溫度過高，會(huì)造成膠體脫位
• 電泳時(shí)，電壓25伏為佳，建議控制電泳液量達(dá)到要求  
• 細(xì)胞DNA損傷彗星圖像如下（400倍）

• 本公司提供系列DNA損傷檢測(cè)分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定重復(fù)性好